Методика поверки «Амплифакторы нуклеиновых кислот с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени » (мп 244-0009-2020 )

Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии имени Д.И. Менделеева»

ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева»

СОГЛАСОВАНО

директора И. Менделеева» А.Н. Пронин ноября 2020 г.

Государственная система обеспечения единства измерений

Амплификаторы нуклеиновых кислот с гибридизационнофлуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени Applied Biosystems QuantStudio 5 Методика поверки

МП 244-0009-2020

И.о. руководителя НПО госэталонов и стандартных образцов в области биоаналитических и медицинских измерений им. Д.И.Менделеева» М.С. Вонский

ФГУП «В

Разработчик:

Руководщдац/сектора № 2442

А.А. Чубанов

г. Санкт-Петербург 2020 г.

Настоящая методика распространяется на амплификаторы нуклеиновых кислот с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени Applied Biosystems QuantStudio 5, предназначенные для измерения концентрации (массовой доли) фрагментов целевой ДНК в исследуемых пробах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, (далее - приборы).

Методика поверки должна обеспечивать прослеживаемость поверяемых приборов к государственному первичному ГПЭ единиц массовой (молярной) доли и массовой (молярной) концентрации органических компонентов в жидких и твердых веществах и материалах на основе жидкостной и газовой хромато-масс-спектрометрии с изотопным разбавлением и гравиметрии ГЭТ208-2019.

Метод, обеспечивающий реализацию методики поверки - прямое измерение поверяемым СИ величины, воспроизводимой стандартным образцом ГСО 9866-2011 СО состава ДНК сои (комплект ГМ-СОЯ-ВНИИМ).

Методикой поверки не предусмотрена возможность проведения поверки на меньшем числе поддиапазонов измерений.

Приборы подлежат первичной и периодической поверке.

Интервал между поверками - 1 год.

Объем и последовательность операций поверки указаны в таблице 1.

Таблица 1

При получении отрицательных результатов при проведении той или иной

кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

• 6.1 Внешний осмотр

При проведении внешнего осмотра прибор проверяется на соответствие следующим требованиям:

• - отсутствие внешних повреждений, влияющих на точность показаний;

• - отсутствие механических повреждений;

• -  соответствие комплектности прибора технической документации;

• -  исправность органов управления и настройки;

• - соответствие внешнего вида СИ описанию типа СИ;

• -  наличие знака утверждения типа в месте, указанном в описании типа СИ;

• - контроль соблюдения требований по защите СИ от несанкционированного доступа, указанных в описании типа СИ;

• -  отсутствие дефектов, способных оказать влияние на безопасность проведения поверки и (или) на результаты поверки; устранение выявленных дефектов до начала поверки.

Прибор считается выдержавшим внешний осмотр, если он соответствует перечисленным выше требованиям.

Прибор с механическими повреждениями к поверке не допускается.

• 6.2 Подготовка к поверке и опробование средства измерений.

В соответствии с указаниями Руководства по эксплуатации включить прибор. Результаты проверки общей работоспособности прибора считаются положительными, если прибор включается, на дисплее прибора после загрузки отображается название прибора и предложение запрограммировать прогон.

• 6.3 Проверка программного обеспечения СИ

При проведении поверки приборов выполняют операцию «Подтверждение соответствия программного обеспечения». Операция «Подтверждение соответствия программного обеспечения» состоит в определении номеров версий автономного и встроенного (прошивка) программного обеспечения.

Автономное программное обеспечение запускается при нажатии на иконку «QuantStudio Design&Analysis Software» на рабочем столе управляющего компьютера (устройство должно быть включено).

Просмотр версии автономного ПО «QuantStudio Design&Analysis Software» для устройств происходит следующим образом: запустить программу «QuantStudio Design&Analysis Software» пользователем с правами Администратора, нажать на кнопку «Help»

Затем в выпадающем меню войти в пункт «about QuantStudio Design&Analysis Software», далее откроется всплывающий баннер с информацией о версии программы. Также номер версии отображается в шапке окна программы.

Просмотр версии прошивки доступен при подключенном приборе, через сенсорный экран в меню Settings (Свойства) -> About instrument (О приборе).

Устройство считается прошедшим поверку, если номера версии совпадает с номером версии или выше номера версии, указанного в описании типа.

• 6.4 Определение метрологических характеристик

  • 6.4.1 Подготовить наборы реагентов в соответствии с их инструкциями по применению. Подготовить пробирку (1,5 мл) для приготовления реакционной смеси.

  • 6.4.2  Подготовить и подписать 4 микропробирки (0,5 мл) для приготовления градуировочных растворов (Ст1, Ст2, СтЗ, Ст4).

  • 6.4.3 Подготовить 28 микропробирки для проведения ПЦР, подписать на боку пробирок: С1 - 4 пгг., С2 - 4 пгг., СЗ - 4 шт., С4 - 4 пгг., К1 -10 пгг., ОКО - 2 шт. Писать на крышках пробирок запрещено!

  • 6.4.4 Приготовить реакционную смесь.

    • 6.4.4.1 Разморозить 2 пробирки с ПЦР-смесью «Соя GTS 40-3-2» (1 пробирка рассчитана на постановку 25 реакций). Перемешать на центрифуге-вортексе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

    • 6.4.4.2 Для проведения 28 реакций смешать в отдельной пробирке на 1,5 мл (по п. 6.4.1) 588 мкл ПЦР-смеси и 9,2 мкл Taq ДНК-полимеразы. перемешать смесь на вортексе и осадить капли кратковременным центрифугированием

  • 6.4.5 Приготовить градуировочные растворы.

Для приготовления градуировочных растворов используется ГСО «ГМ-СОЯ-ВНИИМ-5» и его последовательные разведения в деионизированной воде. Для построения градуировочных кривых используются следующие градуировочные растворы:

Таблица 3

• 6.4.5.2 Перенести 36 мкл раствора ГСО из пробирки «ГМ-СОЯ-ВНИИМ-5» в пробирку Ст1 (по п. 6.4.2).

• 6.4.5.3 В пробирке Ст2 (по п. 6.4.2) смешать 12 мкл ГСО «ГМ-СОЯ-ВНИИМ-5» из пробирки Ст1 и 24 мкл деионизованной воды, полученный раствор тщательно перемешать на центрифуге-вортексе и центрифугировать в течение нескольких секунд для сброса капель.

• 6.4.5.4 В пробирке СтЗ (по п. 6.4.2) смешать 12 мкл раствора из пробирки Ст2 и 24 мкл деионизованной воды, полученный раствор тщательно перемешать на центрифуге-вортексе и центрифугировать в течение нескольких секунд для сброса капель.

• 6.4.5.5 В пробирке Ст4 (по п. 6.4.2) смешать 12 мкл раствора из пробирки СтЗ и 24 мкл деионизованной воды, полученный раствор тщательно перемешать на центрифуге-вортексе и центрифугировать в течение нескольких секунд для сброса капель.

Примечание: данные объемы указаны исходя из 4-кратного дублирования для каждого из 4-х реакционных растворов.

6.4.6 Подготовить отрицательный контроль и контрольные образцы.

• 6.4.6.1 Разморозить пробирку отрицательного контрольного образца (ОКО) из набора «Соя GTS 40-3-2 идентификация», тщательно перемешать на центрифуге-вортексе и центрифугировать в течение нескольких секунд для сброса капель.

• 6.4.6.2 Разморозить пробирку ГСО 9866-2011 «ГМ-СОЯ-ВНИИМ-1» (К1, исследуемый образец), тщательно перемешать на центрифуге-вортексе и центрифугировать в течение нескольких секунд для сброса капель.

6.4.7. В каждую пробирку для проведения ПЦР (по п. 6.4.3) внести 20 мкл реакционного раствора и по 5 мкл образца/градуировочного раствора/отрицательного контроля в соответствии с Таблицей 4.

Таблица 4.

• 6.4.8 Закрыть пробирки крышками и поместить их в термоблок прибора в следующей последовательности: С1 - 4 шт., С2 - 4 пгг., СЗ - 4 пгг., С4 - 4 шт., К1 - 10 шт., ОКО - 2 шт. Закрыть прибор.

• 6.4.9  Запрограммировать прибор для выполнения соответствующей программы амплификации и детектирования флуоресцентного сигнала и провести ПЦР-реакцию в режиме реального времени:

• 6.4.9.1 Нажать на иконку «Create new experiment».

• 6.4.9.2 В появившемся окне задать название эксперимента, выбрать тип эксперимента «Standard curve», реагенты «TaqMan Reagents», режим работы «Standard»; нажать «Next» для перехода к заданию параметров амплификации.

• 6.4.9.3 В появившемся окне задать циклограмму со следующими параметрами:

«Hold» -    50°С for 2:00 min

94°С for 5:00 min

«Cycling» - 50 cycles

95°C for 15 s

59°C for 40 s + установить получение данных выделив иконку камеры.

В том же окне задать объем образца 25 мкл. Перейти к следующему экрану, нажав «Next»

• 6.4.9.4 Слева выбрать отсутствие референсного красителя (поменять слева снизу «ROX» на «None»)

• 6.4.9.5 Перейти к расширенным опциям определения образцов (слева сверху вкладка «Advanced setup»

• 6.4.9.6 В поле Мишени («Targets») удалить мишень по умолчанию, добавить мишень «SOY» (натуральная соя), задать для неё краситель VIC; добавить мишень «GM» (ГМ-соя), задать для неё краситель ROX

• 6.4.9.7 В поле Образцы («Samples») удалить образец по умолчанию, добавить образцы в соответствие с п.4.2.2.1.

Справа на схеме планшета последовательно выделяя группы образцов, задать для них соответствующие имена (слева), для всех образцов выбрать оба красителя; для образцов Cl - С4 задать в поле «Task» значок «S» (Стандарт) для каждой мишени, в поле «Quantity» (количество) задать условные концентрации для каждой мишени в соответствии с таблицей 2. Для остальных образцов задать в поле «Task» значок «U» (Неизвестный)

Нажать «Next» для перехода к окну запуска программы амплификации.

• 6.4.9.8 Наверху справа нажать иконку «Start Run», в выпадающем меню выбрать испытываемый прибор. Дождаться окончания амплификации.

• 6.4.10 Получить значения условных концентраций для всех образцов для обоих каналов.

• 6.4.10.1 Во вкладке Results на схеме планшета выделить все образцы. Вверху справа нажать «Analyze» для проведения автоматического анализа результата. Допускается проведение анализа (определение пороговых циклов) в ручном режиме под контролем опытного пользователя ПО QuantStufio Design&Analysis Software.

• 6.4.10.2 Для каждого канала провести анализ градуировочной кривой: выбрать справа сверху в выпадающем меню пункт «Standard Curve»; щёлкнув по иконке свойств графика последовательно выставить первую и вторую мишень; для каждой мишени записать значения эффективности амплификации. R². При значениях R² < 95 % или значениях эффективности менее 85 % результаты ПЦР считаются недостоверными.

• 6.4.10.3 На вкладке с видом образцов перейти к табличному виду, щёлкнув на соответствующую иконку.

Щелкнув правой кнопкой по шапке таблицы добавить к отображаемым параметрам пункт «Quantity» (Количество).

• 6.4.10.4 Занести в таблицу 6 значения условных концентраций ДНК сои (VIC) и ДНК гм-сои (ROX) для каждой повторности образцов К1 и К0,1 и рассчитать значение массовой доли ДНК генетически модифицированной сои в ДНК натуральной сои по формуле 1

Кизм [-1 = 1000 х ^у-‘^(й0^        (1)

^изм 1_кг1               K_i(yiC)            ^{v 7}

Таблица 6.

• 6.4.11 Рассчитать среднее значение массовой доли ДНК генетически модифицированной сои линии 40-3-2 в ДНК натуральной сои в ГСО «ГМ-СОЯ-ВНИИМ-1».

Допускается исключение не более 2х результатов в случае выброса из-за ошибки оператора при раскапывании ПЦР-смеси, необходимо учесть исключение выбросов при расчете СКО (по п. 6.4.13, см. ниже).

• 6.4.12 Рассчитать значение относительной погрешности измерений массовой доли ДНК генетически модифицированной сои линии 40-3-2 в ДНК натуральной сои в ГСО «ГМ-СОЯ-ВНИИМ-1» по формуле

  
  

  х100%,

  (2)

Кспец - паспортное значение массовой доли ДНК генетически модифицированной сои линии 40-3-2 в ДНК натуральной сои в ГСО «ГМ-СОЯ-ВНИИМ-1». Результат вычисления заносится в протокол.

• 6.4.13 Рассчитать значение относительного СКО случайной составляющей погрешности результата измерения значения массовой доли ДНК генетически модифицированной сои в ДНК натуральной сои в ГСО «ГМ-СОЯ-ВНИИМ-1» по формуле 3

ю       __

£ (KI I-K1»,»)²

S = ==— 1 -i=i-------------X 100 %

К1 и,м V            9

Результат вычисления заносится в протокол.

6.5 Подтверждение соответствия средства измерения метрологическим требованиям

• 6.5.1  Результат построения градуировочных графиков считается положительным (п. 6.4.10.2), если значения коэффициентов корреляции R² составляют не менее 0,95.

• 6.5.2 Прибор считается прошедшим поверку по п. 6.4.12, если относительная погрешность определения массовой доли ДНК генетически модифицированной сои линии 40-3-2 в ДНК натуральной сои в образце ГМ-СОЯ-ВНИИМ-1 не превышает ±25 %.

• 6.5.3 Прибор считается прошедшим поверку по п. 6.4.13, если относительное СКО случайной составляющей погрешности определения массовой доли ДНК генетически модифицированной сои линии 40-3-2 в ДНК натуральной сое в образце ГМ-СОЯ-ВНИИМ-1 не превышает 15 %.

• 6.5.4 Проверка диапазона измерения при использовании ГСО 9866-2011 состава ДНК сои (КОМПЛЕКТ ГМ-СОЯ-ВНИИМ) проводится одновременно с определением погрешности прибора. Линейность градуировочного графика свидетельствует о корректной работе прибора в диапазоне измерений от 1 г/кг до 50 г/кг массовой доли ГМ ДНК к ДНК натуральной сои.

• 6.5.5 Прибор считается полностью прошедшим поверку, при удовлетворении всех требований, изложенных в п.п. 6.5.1-6.5.4.

• 7.1. При проведении поверки составляется протокол поверки результатов измерений по форме Приложения А.

• 7.2. Результаты поверки считаются положительными, если прибор удовлетворяет всем требованиям описания типа. Аккредитованное на поверку лицо, проводившее поверку, в случае положительных результатов поверки (подтверждено соответствие средств измерений метрологическим требованиям) заносит данные в ФИФ, наносит знак поверки на средства измерений и (или) выдает свидетельства о поверке (по запросу заявителя), оформленные в соответствии с требованиями к содержанию свидетельства о поверке.

• 7.3. Результаты считаются отрицательными, если при проведении поверки установлено несоответствие поверяемого анализатора хотя бы одному из требований описания типа. Отрицательные результаты поверки заносятся в ФИФ с указанием причин непригодности.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРОТОКОЛ ПОВЕРКИ

№          от ХХ.ХХ.20ХХ г.

Вид поверки____________________________________________________________________

Методика поверки_______________________________________________________________

Средства поверки:

Условия поверки:

Результаты поверки:

• 1. Внешний осмотр _____________________________________________________________

• 2. Опробование_____________________________________________________________________

• 3.  Подтверждение соответствия ПО________________________________________________________

• 4. Определение метрологических характеристик (в соответствии с требованиями НД на

методы и средства поверки)

5. Дополнительная информация (состояние объекта поверки, сведения о ремонте, юстировке)

9