Методика поверки «ГСОЕИ. Анализаторы Evidence Investigator» (МП-244-0007-2020)

Федеральное государственное унитарное предприятие «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И. Менделеева» ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева»

Государственная система обеспечения единства измерений

Методика поверки

МП-244-0007-2020

И.о. руководителя научно-исследовательского отдела государственных эталонов и стандартных образцов

в области биоаналитических и медицинских измерений

Вонский

Руководитель сектора государственных эталонов и стандартных образцов в облас       аторной медицины

'                   Кустова

г. Санкт-Петербург 2020 г.

Настоящая методика поверки распространяется на анализаторы Evidence Investigator (далее - анализаторы), предназначенные для измерения массовой концентрации левомицетина (хлорамфеникола), а также - определения антибиотиков, противопаразитар-ных средств, кокцидиостатиков, гормонов роста, синтетических стероидов, пестицидов, микотоксинов (далее - токсичные вещества) в пробах животного и растительного происхождения.

Анализаторы подлежат первичной поверке до ввода в эксплуатацию и после ремонта и периодической в эксплуатации.

• 1.1 Объем и последовательность операций поверки указаны в таблице 1.

Таблица 1

Если при проведении той или иной операции поверки получен отрицательный результат, дальнейшее выполнение поверки прекращают.

• 2.1 При проведении поверки применяют средства поверки и вспомогательное оборудование, представленные в таблице 2.

Таблица 2

2.2 Допускается применение аналогичных средств поверки, обеспечивающих определение метрологических характеристик поверяемого СИ с требуемой точностью.

• 4.1. При проведении поверки соблюдают следующие условия:

• - температура окружающего воздуха, °C                   от +16 до +25;

• - атмосферное давление, кПа                              от 50 до 106;

• - относительная влажность воздуха, %                      не более 85.

• 4.2. Установка и подготовка анализатора к поверке, выполнение операций при проведении измерений осуществляют в соответствии с эксплуатационной документацией.

При проведении внешнего осмотра анализатор проверяют на соответствие следующим требованиям:

• •    отсутствие повреждений, влияющих на работоспособность анализатора;

• •    соответствие комплектности и маркировки анализатора требованиям технической документации;

• •    исправность органов управления и настройки;

Анализатор с механическими повреждениями к поверке не допускают.

Анализатор считают выдержавшим внешний осмотр, если он соответствует выше перечисленным требованиям.

Подготавливают анализатор к работе в соответствии с Руководством по эксплуатации. Включают электрическое питание анализатора. Проверяют функционирование анализатора согласно технической документации фирмы-изготовителя.

При подтверждении соответствия программного обеспечения определяют идентификационное наименование ПО, номер версии (идентификационного номера) программного обеспечения, цифровой идентификатор ПО, алгоритм вычисления контрольной суммы исполняемого кода, в соответствии с процедурами, изложенными в руководстве по эксплуатации.

Результат проверки считают положительным, если отображаемые идентификационные данные соответствуют указанным в разделе «Программное обеспечение» описании типа или в таблице 3.

Таблица 3

• 5.4 Определение метрологических характеристик

Определение относительной погрешности анализатора при измерении массовой концентрации левомицетина (хлорамфеникола) проводят по трем контрольным растворам:

КР №1 2 нг/см³ (2 ppb), КР №2 1 нг/см³ (1 ppb), КР №3 0,6 нг/см³ (0,6 ppb).

Приготовление контрольных растворов левомицетина (хлорамфеникола) проводят с применением ГСО 10165-2012 СО состава левомицетина согласно Приложению Б.

Относительную погрешность анализатора при измерении массовой концентрации левомицетина (хлорамфеникола) определяют путем сравнения значений массовой концентрации в контрольных растворах с расчетными значениями.

Проводят проверку калибровки и измерение массовой концентрации левомицетина (хлорамфеникола) согласно инструкции, приведенной в Приложение В (соответствующие лунки биочипов с 1-ой по 3-тью на второй кассете).

Относительную погрешность анализатора при измерении массовой концентрации левомицетина (хлорамфеникола) (5_С) рассчитывают по формуле:

5_c=^V^-100%                 (1)

^xC,i                                                          ^{v 7}

Хс - значение массовой концентрации измеренное анализатором, нг/см³ (ppb);

Xc.i - расчетное значение массовой концентрации в i-м контрольном растворе (КР № 1-3), нг/см³ (ppb);

Результаты определения относительной погрешности анализатора при измерении массовой концентрации левомицетина (хлорамфеникола) считают положительными, если полученные значения 6_С для всех контрольных растворов не превышают ±30 %.

Для определения относительного СКО результатов измерения левомицетина (хлорамфеникола) используется контрольный раствор хлорамфеникола КР №1 2 нг/см³ (2 ppb). Приготовление раствора проводят согласно Приложению Б.

Измерение значений массовой концентрации при определении относительного СКО проводят по хлорамфениколу согласно Приложению В. Выполняют 5 независимых измерений (соответствующие лунки биочипов с 4-ой по 8-ую на второй кассете).

Относительное СКО результатов измерения левомицетина (хлорамфеникола) (оотн.) вычисляют по формуле:

- х)²

^оти. = -------S--100 %

п ■ X

где Xi - i-e измерение массовой концентрации, нг/см³ (ppb);

X - среднее арифметическое независимых измерений массовой концентрации, нг/см³ (ppb);

п - число независимых измерений (п=5).

Результат определения относительного СКО результатов измерения левомицетина (хлорамфеникола) считают положительным, если полученное значение ст_0ТН не превышает ±10%.

• 6.1. При проведении поверки оформляется протокол поверки, форма которого указана в Приложении А.

• 6.2. Анализаторы, удовлетворяющие требованиям настоящей методики поверки, признаются годными.

6.3 Положительные результаты поверки анализатора оформляют выдачей свидетельства о поверке в соответствии с «Порядком проведения поверки средств измерений, требования к знаку поверки и содержанию свидетельства о поверке» (утв. Приказом Министерства промышленности и торговли РФ от 2 июля 2015 г. № 1815).

6.4. Анализатор, не удовлетворяющий требованиям настоящей методики, к эксплуатации не допускается. Свидетельство о поверке изымают и выдают извещение о непригодности с указанием причин в соответствии с «Порядком проведения поверки средств измерений, требования к знаку поверки и содержанию свидетельства о поверке» (утв. Приказом Министерства промышленности и торговли РФ от 2 июля 2015 г. № 1815).

Приложение А (Рекомендуемое)

ПРОТОКОЛ ПОВЕРКИ

№         от ХХ.ХХ.20ХХ г.

Вид поверки_____________________________________________________________

Методика поверки_______________________________________________________

Средства поверки:

Условия поверки:

Результаты поверки:

• 1.  Внешний осмотр______________________________________________________________

• 2.  Опробование.___________________________________________________________________

• 3.  Подтверждение соответствия ПО______________________________________________

• 4.  Определение метрологических характеристик (в соответствии с требованиями НД на методы и средства поверки)

  • 4.1 Определение относительной погрешности анализатора и относительного СКО результатов измерения массовой концентрации хлорамфеникола

- Определение относительной погрешности при измерении массовой концентрации хлорамфеникола

- Определение относительного CKO результатов измерений левомицетина (хлорамфеникола)_________________________________________________________________________________________

Заключение о поверке :_________________________________________________________<

свидетельство о поверке №__________________________от_______________________

Поверитель________________________

Дата поверки______________________

Приложение Б Приготовление контрольных растворов левомицетина (хлорамфеникола), вспомогательных растворов, и подготовка биочипов к измерениям.

• 1.1 Готовят раствор хлорамфеникола 1мг/см³ (10⁶ ppb) (раствор № 1). Для этого к 1,814 мг левомицетина (ГСО 10165-2012) добавляют 1,431 г метанола технического (ГОСТ 2222-95).

• 1.2 Готовят раствор хлорамфеникола 10 мкг/см³ (10⁴ ppb) (раствор № 2). Для этого в 1980 мкл метанола технического вносят дозатором 20 мкл раствора № 1, несколько раз промывая наконечник.

• 1.3 Готовят рабочий промывочный буфер. К 32 мл концентрата промывочного буфера, входящего в состав Тест-системы Антимикробная панель III Cap Only, добавляют 968 мл дистиллированной воды.

• 1.4 Готовят раствор хлорамфеникола 10² нг/см³ (10² ppb) (раствор № 3). В 1980 мкл промывочного буфера рабочей концентрации, вносят 20 мкл раствора № 2 и перемешивают.

• 1.5 Готовят раствор хлорамфеникола 20 нг/см³ (20 ppb) (раствор № 4). В 400 мкл промывочного буфера рабочей концентрации вносят 100 мкл раствора № 3 и перемешивают.

• 1.6 Готовят три контрольных раствора (КР) следующих концентраций:

• - КР №1 2 нг/см³ (2 ppb);

• - КР №2 1 нг/см³ (1 ppb);

• - КР №3 0,6 нг/см³ (0,6 ppb).

а) Готовят КР № 1 2 нг/см³ (2 ppb). Для этого в 900 мкл промывочного буфера рабочей концентрации вносят 100 мкл раствора № 4. Несколько раз промывают наконечник и перемешивают.

б) Готовят КР № 2 1 нг/см³ (1 ppb). Для этого в 950 мкл промывочного буфера рабочей концентрации вносят 50 мкл раствора № 4. Несколько раз промывают наконечник и перемешивают.

в) Готовят КР № 3 0,6 нг/см³ (0,6 ppb). Для этого в 970 мкл промывочного буфера рабочей концентрации вносят 30 мкл раствора № 4. Несколько раз промывают наконечник и перемешивают.

• 2.1 Приготовление вспомогательных растворов производят с применением Тест-системы Антимикробная панель III Cap Only в составе:

• - Раствор для разведения -1x13 мл;

• - Конъюгат (концентрат) -1x1 мл;

• - Раствор для разведения (концентрат) -1x12 мл;

• - Биочип - 54 биочипа;

• - Калибратор - 9 х 1 мл;

• - Пероксид - 1 х 10 мл;

• - Люминол-ЕУ805 - 1 x 10 мл;

• - Промывочный буфер (концентрат) - 1 х 32 мл;

• - Раствор для разведения - 1 х 30 мл;

• - Диск для калибровки и штрих-коды - 1 шт;

• - Буфер для экстракции ткани (концентрат) - 1шт.

• 2.2 Достают 9 флаконов с калибраторами. Они лиофилизированы, т.е. находятся в сухом состоянии. Вскрывают, чуть отогнув резиновую пробку, чтобы вошел воздух. Пробку резиновую приподнимают, не снимая. Вносят 1 мл деонизированной воды, прислоняя наконечник дозатора к горлышку флакона. Закрывают флакон с калибратором. Такие манипуляции проводят с калибраторами от 1 до 9. Ставят флаконы с калибраторами на термошейкер, входящий в состав анализатора, на 30 минут при 370 об/мин, 25 °C.

• 2.3 Раствор коньюгата готовят следующим образом:

10 концентрированный конъюгат разбавляют с помощью разбавителя конъюгата. Берут флакон с концентрированным конъюгатом, открывают пластиковую крышку, приподнимают резиновую пробку, впускают воздух. Берут 1 мл из флакона с разбавителем конъюгата и добавляют во флакон с концентрированным конъюгатом.

Ставят флаконы с калибраторами на термошейкер, входящий в состав анализатора, на 30 минут при 370 об/мин, 25 °C

• 3.1 Достают флаконы с калибраторами с термошейкера (п.2.3), расставляют на столе в порядке от 1-го до 9-го.

Понадобится две кассеты биочипов: одна кассета с 9 биочипами для калибровки и одна касета с 8 биочипами для контрольных растворов (первые три для КР №1, КР №2, КР №3, и пять для КР №1).

Вскрывают пакет с защелкой (гриппер), вынимают из него 2 кассеты с биочипами. Подписывают маркером положение каждого биочипа. Во второй кассете 9-й биочип вынуть и положить обратно в гриппер (подписать количество биочипов и дату вскрытия упаковки). Срок годности биочипов указан в инструкции.

Закрепляют первую кассету под калибровку на носителе кассет.

Вносят раствор для разведения 150 мкл обратным пипетированием в нижний левый угол лунки каждого биочипа, не касаясь его.

Вынимают резиновую пробку из флаконов с калибраторами (от 1 до 9) и вносят по 50 мкл калибратора прямым пипетированием в левый ближний угол лунки каждого биочипа, не касаясь его. Стараться, чтобы не образовывались пузырьки. Если пузырьки образовались, то коснуться одноразовым наконечником пузырька, чтобы он лопнул (не касаясь биочипа, т.к. можно повредить нанесенные на пластину антитела).

Калибраторы стабильны в течение 4х недель в холодильнике при температуре от +2 до +8 °C.

Закрепляют вторую кассету для контрольных растворов на носителе кассет. Перемешиваем КР № 1, КР № 2, КР №3. Вносим по 50 мкл каждого контрольного раствора в лунки биочипов 1 - 3, в левый ближний угол. В лунки биочипов 4-8 вносим по 50мклКР№1.

Инкубируют 30 минут на термошейкере при 370 об/мин, 25 °C. Перед тем, как установить носитель кассет на термошейкер, аккуратно постучать пальцами со всех сторон носителя, чтобы реактивы перемешались. Помещаем носитель кассет в термошейкер, фиксируя на специальном штырьке. Закрыть термошейкер, нажать RPM (запуск).

• 3.2 Через 15 минут после начала инкубации начинаем готовить рабочий раствор конъюгата для нанесения на биочипы.

Добавляем в чистую пробирку 2 раза по 980 мкл разбавителя конъюгата и 40 мкл концентрированного коньюгата. После добавления конъюгата несколько раз промываем наконечник в разбавителе.

Перемешиваем рабочий раствор коньюгата, на термошейкере, входящим в состав анализатора, 15 минут при 370 об/мин, 25 °C.

• 3.3 Достаем из термошейкера носитель кассет.

Далее, наносим коньюгат на биочип: 100 мкл рабочего раствора коньюгата вносим прямым пипетированием в левый ближний угол лунки каждого биочипа касаясь только стенки (в лунки 1-9 биочипов первой плашки и в лунки 1-8 биочипов второй плашки).

Инкубируем на термошейкере в течение 60 минут, при 370 об/мин, 25 °C. Большим и указательным пальцем берем носитель кассет, фиксируем его на штырьке термошейкера, нажимаем кнопку RPM (запуск).

• 3.4 Готовим раствор субстрата, пока идет инкубация. Для подготовки понадобится раствор люминола и раствор пероксидазы хрена. Берем пробирку из темного стекла. Добавляем в пробирку сначала 3 мл раствора пероксидазы хрена, затем 3 мл раствора люминола. Перемешиваем раствор субстрата на термошейкере, входящим в состав анализатора, 15 минут при 370 об/мин, 25 °C (раствор стабилен в течение 4 часов после перемешивания).

• 3.5 Подготавливаем буферный раствор для промывки. Для приготовления 1 литра раствора смешиваем 32 мл концентрата промывочного буфера с 968 мл деионизованной воды.

• 3.6 После окончания инкубации проводим промывку буферным раствором для промывки комнатной температуры. Жидкость с носителя кассет выливаем перевернув и встряхнув его несколько раз. Всего проводим 6 промывок в соответствии с РЭ. Для первых двух быстрых промывок заполняем все лунки биочипов наполовину буферным раствором для промывки. Простукиваем пальцами 10 секунд с торца носителя кассет с каждой стороны. Жидкость из лунки не должна попасть в соседнюю лунку. Резким движением переворачиваем, сливаем жидкость в раковину, встряхиваем несколько раз. Повторяем второй раз. Следующие четыре промывки выполняем также, увеличивая время инкубации с буферным раствором для промывок до двух минут. Далее, снова заполняем все лунки биочипов наполовину буферным раствором для промывки, накрываем носитель кассет фольгой, предотвращая доступ света.

12 Приложение В Проведение измерений массовой концентрации левомицетина (хлорамфеникола) на анализаторе

• 1. Вставляем диск для калибровки, входящий в состав Тест-системы Антимикробная панель III Cap Only, в дисковод анализатора для загрузки данных калибровки. Появляется автозапуск на экране монитора. Нажимаем «Start», «Ок», ждем несколько секунд, далее нажимаем «Yes», происходит обновление концентраций, далее «Close», далее «Ок». Далее, запускаем программу. Вводим логин и пароль, нажимаем «Ок» и ждем примерно 5 минут. Рабочая камера анализатора охлаждается до -50 °C. После завершения охлаждения нажимаем «Ок». Переходим к пункту «Sample Entry» в левом верхнем углу экрана. Вписываем название тест-системы AM III (CAP only) и дату в английском формате «месяц, день, год», количество кассет «2», количество аналитов «all» (все), нажимаем «Continue» (Продолжить). Вместе с калибраторами имеется лист со штрих-кодами. В программе нажимаем «Calibration» (Калибровка), выбираем тест-систему AM III (CAP only). Берем сканер штрихкодов. Считываем штрих-код тест-системы (первый в левом столбце на листе). Далее, считываем штрих-коды калибраторов с 1 до 9. На компьютере они проставляются автоматически. Нажимаем «Accept Calibration» (Принять калибровку).

• 2. Вводим данные об образцах в программу. Выбираем «Sample», выбираем тест-систему AM III (CAP only), сканируем штрих-код тест-системы. Описываем лунки образцов: в поле «spike 1» вносим 2 ppb, в поле «spike 2» -1 ppb, в поле «spike 3» - 0,6 ppb, в поле «spike 4» - 2 ppb, в поле «spike 5» - 2 ppb), в поле «spike 6» - 2 ppb, в поле «spike 7» - 2 ppb, в поле «spike 8» - 2 ppb. Выбираем «Accept Samples», «Yes» (использовать только восемь лунок). Девятая лунка пустая. Выбираем «Accept Samples». Появится Окно «Please, open the door». Подтверждаем «Ок».

• 3. Снимаем с носителя кассет фольгу, берем первую кассету с калибраторами, вторую закрываем фольгой. Включаем таймер, сливаем воду с кассеты. Высушиваем кассету, используя неворсистую бумагу: заворачиваем в бумагу кассету, лунки смотрят вниз, простукиваем ладонью, чтобы влага вышла. Повторяем процедуру, завернув кассету в чистую сухую бумагу, до тех пор, пока бумага не останется сухой.

Вносим 250 мкл раствора субстрата обратным пипетированием в лунку каждого биочипа от 1 до 9 (в левый ближний угол). Закрываем кассету фольгой, включаем таймер на 2 минуты. Помещаем кассету на автоподатчик анализатора. Калибровка происходит в течение трех минут.

• 4. Проводим подготовку кассеты с контрольными растворами (вторая кассета). Высушиваем салфетками, вносим в лунку каждого биочипа (с 1 до 8) по 250 мкл раствора субстрата. Закрываем кассету фольгой, включаем таймер на 2 минуты. Помещаем кассету на автоподатчик анализатора.

Результаты измерений сохраняются в рабочем листе. Нажать «Ок».

• 5. Заходим в раздел «Calibration History», выбираем нужную тест-систему AM III (CAP only), выбираем дату, время. Проверяем график калибровки. Точки должны лежать на кривой. Если точки выпадают, они будут окрашены красным цветом. Для каждой лунки в графе «Analyte Results» указанные ожидаемые значения содержания хлорамфеникола калибровочных растворов (столбец таблицы «Expected») должны совпадать с полученными (столбец таблицы «Actual»).

7. Результаты измерений предствлены в разделе «Result History».